Navštivte také

Předchozí reklama
Následující reklama
Počet záznamů: 12
Navštivte také: MZe ČR – Bezpečnost potravin
MZe ČR – Bezpečnost potravin
Navštivte také: Ministerstvo zdravotnictví ČR
Ministerstvo zdravotnictví ČR
Navštivte také: Státní zemědělská a potravinářská inspekce
Státní zemědělská a potravinářská inspekce
Navštivte také: Státní veterinární správa ČR
Státní veterinární správa ČR
Navštivte také: Ústřední kontrolní a zkušební ústav zemědělský
Ústřední kontrolní a zkušební ústav zemědělský
Navštivte také: Evropský úřad pro bezpečnost potravin
Evropský úřad pro bezpečnost potravin
Navštivte také: Státní zdravotní ústav
Státní zdravotní ústav
Navštivte také: Meziresortní komise pro řešení jódového deficitu
Meziresortní komise pro řešení jódového deficitu
Navštivte také: Kancelář WHO v České republice
Kancelář WHO v České republice
Navštivte také: Víš co jíš? (informace o výživě)
Víš co jíš? (informace o výživě)
Navštivte také: Knowledge Junction EFSA
Knowledge Junction EFSA
Navštivte také: Evropská rada pro informace o potravinách
Evropská rada pro informace o potravinách

Přidat článek Nová varianta CRISPR/Cas9 rozšiřuje možnosti editace genomu do kategorie

Geneticky modifikované potraviny a krmiva > Geneticky modifikované potraviny a krmiva
Aktuality > Aktuality

Nová varianta CRISPR/Cas9 rozšiřuje možnosti editace genomu

Vydáno: 27.4.2021
Tisk článku
Autor: BIOTRIN
Informace organizace BIOTRIN

V současné době je velmi rozšířený výzkum zaměřený na vývoj a úpravy metod editace genomu. Walton et al. (2020) ve své studii popsali novou variantu nástroje pro editaci genů CRISPR/Cas9 nazvanou SpRY. SpRY odstraňuje bariéry toho, co může a nemůže být „zacíleno“ při editaci genů, takže téměř jakákoliv genomová sekvence v rostlinách může být místem pro cílené úpravy. Účinnost SpRY byla ověřena týmem čínských a amerických vědců v následné studii nedávno publikované v časopise Nature Plants (Ren et al., 2021). 

CRISPR/Cas9 a PAM sekvence

CRISPR/Cas9 je jednoduchý dvousložkový systém, který umožňuje vědcům upravit téměř jakoukoli sekvenci v genomu organismu. Zaměření na konkrétní místo v genomu je dosaženo pomocí tzv. „naváděcí RNA“ (guide RNA, gRNA), která rozpoznává cílovou sekvenci a následně ji ve spolupráci s CRISPR-asociovanou endonukleázou (Cas) štěpí.

Vědci z celého světa, kteří tuto technologii využívají, se při návrzích svých systémů setkávají s jedním důležitým pojmem - sekvence PAM.

Co je to PAM a proč je důležitá při navrhování a využívání CRISPR experimentů? CRISPR/Cas systém je prokaryotický imunitní systém, zajišťující obranu bakterií vůči cizím genetickým elementům, jako jsou plazmidy nebo fágy (bakteriální viry). Bakteriální organismus tyto exogenní genetické elementy rozpozná a deaktivuje je (enzymaticky je „rozřeže“). Jak je ale zajištěno, že fragment virového genomu zabudovaný do bakteriálního genomu (CRISPR oblast) nespustí takovou reakci, při níž by Cas9 rozřezal „vlastní“ bakteriální genom?

Zajistí to právě PAM sekvence. Motiv sousedící s protospacerem (protospacer adjacent motif, PAM) je krátká sekvence DNA (obvykle o délce 2 až 6 párů bází) nezbytná pro štěpení Cas nukleázou a sousedí s oblastí DNA určenou ke štěpení CRISPR systémem. PAM sekvence se obecně nachází 3 – 4 nukleotidy po směru od místa štěpení dvoušroubovice DNA.

Vyskytuje se v napadajícím viru nebo plazmidu, nenachází se ale v genomu bakteriálního hostitele („bránící se“ bakterii) a není proto součástí bakteriálního lokusu (pozice daného genu na chromozomu) CRISPR. Cas9 se nemůže úspěšně navázat a následně štěpit cílovou sekvenci DNA, pokud za ní nenásleduje odpovídající sekvence PAM. PAM je tedy jednou ze základních cílících složek, stejně jako gRNA.

Místa v genomu, na která lze cílit při editaci pomocí CRISPR, jsou tedy determinována nutností přítomnosti PAM sekvencí specifických pro danou nukleázu. Nejčastěji používanou nukleasou je Cas9 ze Streptococcus pyogenes (SpCas9), která rozpoznává PAM sekvenci 5‘-NGG-3‘ (kde „N“ může být jakákoli nukleotidová báze).

Ale co když cílový genomový lokus nenese tuto NGG sekvenci, což se stává poměrně často např. v oblastech bohatých na obsah guaninu a cytocinu (GC)?

Vědci nechtějí být při využívání CRISPR omezeni nutností přítomnosti specifické sekvence PAM. Naštěstí existuje více různých Cas endonukleáz izolovaných z různých bakteriálních druhů a rozpoznávajících jinou PAM. Například SaCas9 (ze Staphylococcus aureus) specificky rozpoznává PAM sekvenci 5‘-NNGRR(N)-3‘. Vědci tedy mají možnost vybrat jinou nukleázu, jejíž odpovídající PAM může být přítomna v cílovém lokusu. Různé nukleázy mohou navíc nabídnout jiné zajímavé vlastnosti; jejich výběr je tak jedním z klíčových kroků při použití CRISPR systému. Přesto jsou však výzkumníky vyžadovány další strategie, které odstraní i zbylá stávající omezení a umožní upravovat genom na libovolném místě. 

SpRY varianta CRISPR/Cas9

Práce Dr. Waltona a jeho kolegů může tento problém zcela změnit, protože umožní úpravy genů pomocí CRISPR/Cas9 v jakékoli sekvenci DNA.

Ve své studii Walton s kolegy geneticky upravili enzym SpCas9 - nejprve vygenerovali upravenou variantu SpCas9 nazvanou SpG; nově upravený SpG může cílit na rozšířenou sadu 5‘-NGN-3‘ PAM oblastí namísto pouze jediné 5‘-NGG-3‘ PAM. Tato změna umožnila systému CRISPR‑Cas9 upravovat čtyřnásobný počet genů oproti původnímu systému. Dále optimalizovali enzym SpCas9 na tzv. SpRY variantu, která dokáže akceptovat téměř všechny „PAM sekvence“ v genomu.

SpRY v podstatě odstraňuje bariéry toho, co může a nemůže být zacíleno při editaci genů, což umožňuje poprvé zacílit téměř jakoukoli genomovou sekvenci (i u rostlin) pro potenciální mutaci. 

Editace rostlin s využitím SpRY

Čínští a američtí vědci (ve studii Ren et al., 2021) ověřovali nový systém SpRY při editaci genomu u rozličných PAM míst v rýži (zástupce jednoděložných rostlin) a u dahurského modřínu pomocí upravené varianty SpRY Cas9. Ukázalo se, že sada nástrojů SpRY opravdu překonává restrikční bariéru PAM i při genomovém inženýrství rostlin a umožňuje úpravy DNA bez závislosti na PAM.

Oprávněná je jistě obava, že díky uvolněným požadavkům na PAM mohou nově vytvořené SpG a SpRY potenciálně generovat více úprav, třeba i mimo cíl (off-target aktivita). K off-target aktivitě dochází dvěma mechanismy. První je daný podobností cílové sekvence s jinými místy v genomu, druhý může být výsledkem samovolné editace sgRNA vnášeného konstruktu. Tyto obavy však nebyly potvrzeny; vědci během provedených experimentů nenašli významné nebo znepokojivé důkazy o SpRY indukovaných mutacích v necílových sekvencích.

Studie Ren et al. (2021) tedy ukazuje, že SpRY umožňuje s minimálními vedlejšími účinky editovat téměř jakoukoliv sekvenci DNA, včetně editace jednotlivých bází, bez přísných restrikcí daných PAM sekvencemi. Tento průlom bude mít zásadní dopad na translační výzkum a šlechtění plodin. Nová varianta technologie CRISPR/Cas9 může být použita na různé druhy plodin, které pomohou při zabezpečení potravin, výživě a bezpečnosti tím, že urychlí vývoj plodin a další zemědělskou revoluci.

 

Zdroje:

 

Zdroj obrázků:

 

Zdroj článku: BIOTRIN

Tyto stránky provozuje Ministerstvo zemědělství © 2021